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故事要从坏蛋斯雷特被忍者神龟彻底打败后说起：纽约市恢复往日安宁，斯普林特老师(马考)为了增强这支地下护卫队的战斗力，把四龟中本事最扎实的达芬奇送往南非进修忍术。没了坏人作恶，神龟们似乎也派不上太大用场，达芬奇走后三个兄弟过着百无聊赖的生活：米开朗基罗靠装扮成乌龟造型的小丑在生日派对上搞搞气氛挣生活费；发明家爱因斯坦则躲在地下世界做技术员；神龟不再发挥神力的时候，纽约市又出现了一个“蝙蝠侠”式的夜行侠维护治安，其实他就是四龟中正义感最强的拉斐尔。
斯普林特派达芬奇进修的用意本来是希望用一个强大的领导者凝聚神龟的力量，结果忙于各自杂务的神龟越来越生疏，骄傲的拉斐尔对达芬奇能担此重任又很不服气，最终在拉斐尔执意独自执行任务时发生一场争吵，出生入死的好兄弟竟一朝反目。
坏人总是在这个时候乘虚而入。百万富翁马克斯(帕特里克•斯图尔特)健康的外表下却有着极其可怕的野心：他潜心收藏世界各地的神秘文物，其实是想在行星位置产生异像的时候利用这些祭器召唤来自远古的邪恶力量，指使一支由怪兽和机械人组成的恐怖军团攻占世界；而斯雷特的余孽部队“鬼脚忍者”在神秘人卡拉(章子怡)的带领下加入邪恶阵营。
大敌当前，纽约市面临从未有过的威胁，组织溃散的忍者神龟该如何重振旗鼓、齐心协力击退实力更可怕的两派对手呢？
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